Celem głównym projektu jest zbadanie właściwości przeciwnowotworowych oraz kontrastujących nowych, wielofunkcyjnych układów liposomalnych typu „theranostic” (określonych jako GdLip). Układy takie mogą znaleźć zastosowanie w połączeniu terapii fotodynamicznej (PDT) z nieinwazyjną diagnostyką obrazową wykorzystującą rezonans magnetyczny (MR). Zaplanowano inkorporację w strukturę liposomów (LIP) GdLip czynnika kontrastowego (tj. lipidowej pochodnej soli kompleksowej gadolinu(III), Gd-DTPA) i modelowego fotouczulacza (ftalocyjaniny cynkowej, ZnPc). Przygotowane zostaną LIP klasyczne, pegylowane (tzw. długokrążące, z przyłączonymi łańcuchami poli(tlenku etylenu)) oraz aktywnie celowane, tzn. sprzężone z przeciwciałem skierowanym przeciwko receptorowi nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR). Autorzy projektu zakładają, że fizyko-chemiczny charakter ZnPc oraz skład lipidowej dwuwarstwy mogą wywierać wzajemne oddziaływania i modyfikować właściwości relaksacyjne paramagnetycznych jonów Gd(III) w obrazowaniu MR. Dlatego też wnioskodawcy zamierzają zweryfikować następujące hipotezy badawcze: 1) stosunek molowy ZnPc i Gd-DTPA w GdLip modyfikuje wpływ lipidowych nanocząstek na czas relaksacji ośrodka, w którym umieszczone zostają liposomy – zmienia właściwości kontrastujące użyteczne w obrazowaniu MR; 2) obecność i stężenie jonów Gd(III) w GdLip nie wpływa na efekt cyto- i fotocytotoksyczny ZnPc; 3) aktywnie celowane LIP zwiększają wychwyt komórkowy ZnPc; 4) zdolności kontrastujące GdLip są porównywalne z komercyjnymi środkami kontrastowymi (Magnevist®). Zakłada się, że GdLip stanowić będą celowany układ terapeutycznodiagnostyczny, który umożliwi obrazowanie zmian nowotworowych wykazujących nadekspresję receptora EGFR, a następnie niszczenie komórek guza przez reaktywne formy tlenu, wytworzone przy udziale ZnPc, w wyniku selektywnego naświetlania patologicznych zmian podczas procedury PDT.

Struktura liposomu GdLip jako układu diagnostyczno-terapeutycznego typu "theranostic"

LIP klasyczne i pegylowane będą otrzymywane metodą hydratacji, a aktywnie celowane zostaną uzyskane w wyniku sprzężenia z przeciwciałami anty-EGFR poprzez hetero-bifunkcjonalny czynnik sieciujący. Do analizy ilościowej składu GdLip wykorzystane zostaną metody chromatograficzne (HPLC). LIP zostaną scharakteryzowane metodą analizy ruchów Brown`a nanocząstek (wielkość) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (wielkość, ocena morfologii). Zmiany fluktuacji funkcji korelacji fluorescencji umożliwią zbadanie oddziaływań GdLip z modelem błony komórkowej (spektroskopia korelacji fluorescencji). Profil i kinetyka uwalniania ZnPc in vitro zostaną wyznaczone metodą frakcjonowania w polu sił (AF4). Cytotoksyczność i fotocytotoksyczność in vitro GdLip będzie badana na modelach komórkowych w układzie 2D i 3D (linie komórkowe nowotworów głowy i szyi oraz prawidłowych fibroblastów). Zaplanowano wykorzystanie szeregu testów biochemicznych umożliwiających zbadanie efektu cytotoksycznego (MTT, LDH), aktywacji szlaków sygnalizacyjnych (m.in. EGFR i apoptozy), oraz zestawów przeznaczonych do badania hodowli komórkowych 3D. Zbadany zostanie stopień wychwytu ZnPc przez komórki wykazujące zróżnicowaną ekspresję receptora EGFR i oceniony będzie wpływ przeciwciała anty-EGFR przyłączonego na powierzchni LIP na wychwyt nośnika przez komórki. Mikroskopia konfokalna posłuży do określenia obszarów lokalizacji subkomórkowej ZnPc. W badaniach biologicznych ZnPc i liposomy zawierające ZnPc (bez Gd-DTPA) posłużą jako pozytywne próby kontrolne. Właściwości kontrastujące GdLip in vitro, będą badane w polach magnetycznych o różnej częstotliwości, po uprzedniej inkubacji z komórkami. W czasie pomiarów zmierzone zostaną czasy relaksacji NMR oraz wyznaczony zostanie parametr relaksacyjności GdLip. Kontrastowane obrazy MR dla komórek inkubowanych z GdLip zostaną otrzymane przy użyciu skanera MRI (9,4 T). Wartości zmierzonych parametrów relaksacyjności uzyskanych dla GdLip zostaną porównane z wynikami literaturowymi komercyjnie dostępnych środków kontrastujących (Magnevist®). W końcowym etapie projektu przeprowadzone zostaną badania in vivo na modelu mysim (ksenografty) obejmujące analizę biodystrybucji, farmakokinetyki oraz ocenę skuteczności i bezpieczeństwa wykorzystania GdLip do obrazowania nowotworu metodą MRI a następnie terapii PDT.

Kolejne etapy działania liposomów GdLip jako potencjalnego układu diagnostyczno-terapeutycznego w obrazowaniu i leczeniu nowotworów (hv - światło, RTF - reaktywne formy tlenu)

Określenie właściwości in vitro i in vivo nowych układów GdLip, wpisuje się w rozwój nowej strategii w PDT. Koncepcja ta polega na połączeniu idei celowanej PDT oraz obrazowania MR. Uzyskane układy potencjalnie mogą przyczynić się do poprawy skuteczności PDT, dzięki możliwości celowanego transportu do komórek nowotworowych (przeciwciało EGFR) oraz śledzenia na obrazach MR różnych etapów terapii (Gd-DTPA). Optymalizacja składu GdLip stwarza także możliwość stosowania
mniejszych ilości pochodnych gadolinu, dzięki uwzględnieniu efektu zwiększania relaksacyjności przez inne komponenty układu. Według wiedzy autorów jest to pierwsza próba zbadania w warunkach in vitro i in vivo liposomów zawierających ZnPc oraz lipidową pochodną Gd-DTPA. Światowe statystyki wskazują na ciągły wzrost liczby zachorowań i śmiertelności w następstwie nowotworów (GLOBOCAN2012). W świetle powyższych doniesień, rozwój nowych rozwiązań diagnostyczno-terapeutycznych, w tym „theranostic”
GdLip, jest uzasadniony i ważny. Podejmowane w projekcie zadania badawcze opierają się na osiągnięciach nanotechnologii leku (celowane liposomy), zakładają wykorzystanie nowoczesnych technik badawczych i metod oceny toksyczności. Realizacja tak interdyscyplinarnego projektu stwarza możliwość podnoszenia i zróżnicowania kwalifikacji oraz rozwoju naukowego wnioskodawców. Autorzy projektu są również przekonani, że uzyskane wyniki badań zostaną opublikowane w indeksowanych czasopismach naukowych.